Eines der Hauptprobleme der Mikroskopie biologischer Objekte ist deren Kontrastarmut. Doch nur dort, wo Kontrast vorhanden ist oder wo ein solcher durch kontraststeigernde Mittel (z.B. selektive Farbstoffe) hergestellt werden kann, lassen sich Strukturen sichtbar machen. Lichtabsorbierende Teile eines Präparats schwächen die Amplitude der durch sie hindurchtretenden Wellenzüge. Man spricht daher auch von Amplitudenpräparaten. Die Lichtschwächungen werden vom Auge als Helligkeitsunterschiede wahrgenommen. Die unsichtbaren Anteile lassen das Licht passieren, wobei es jedoch, je nach Konsistenz der Materie, in seiner Phasenlage verändert wird, weil seine Geschwindigkeit während des Wegs durch das Präparat verringert wird. Solche Phasenunterschiede können aber weder vom Auge noch durch einen photographischen Film erkannt werden.
1935 gelang es dem holländischen Physiker F. ZERNIKE, sie durch eine Manipulation im Strahlengang in Amplitudendifferenzen zu überführen; 1953 wurde ihm dafür der Nobelpreis für Physik zuerkannt. Seine Methode ist als Phasenkontrastmikroskopie bekannt, und die einschlägigen Vorrichtungen sind heute fester Bestandteil nahezu aller Forschungs- und vieler Unterrichtsmikroskope. Ein eminenter Vorteil liegt darin, lebende Objekte beobachten und folglich auch Abläufe in den Zellen verfolgen zu können. So wurde es u.a. möglich, den Ablauf der Mitose sichtbar zu machen und zu filmen (K. MICHEL, Fa. Carl ZEISS, 1943).
Zum Verfahren selbst: Man benötigt einen Spezialkondensor mit einer Ringblende sowie einen "Phasenring", der in der hinteren Brennebene des Objektivs angebracht ist. Dem Phasenring fallen zwei wichtige Aufgaben zu:
Links: Anordnung der Ringblende (unterhalb des Objektivs) und des Phasenrings (im Objektiv). Nur die direkten Lichtstrahlen werden durch den Phasenring beeinflußt (Nach Werkphoto CARL ZEISS)
Rechts: Strahlengang in einem Phasenkontrastmikroskop. 1. Ringblende, 2. Kondensor, 3. Präparat, 4 Objektiv, 5. Phasenplatte, 6. Brennebene des Objektivs. Der Wellencharakter des Lichts wird durch den Wechsel heller und dunkler Bereiche angedeutet (Nach Werkphoto CARL ZEISS).
Er sorgt für eine Angleichung der Helligkeiten von gebeugtem und nichtgebeugtem Licht, weil die durch das Präparat direkt hindurchtretenden Strahlen in ihrer Intensität abgeschwächt werden. Im Gegensatz zu einem konventionellen lichtmikroskopischen Bild erscheint der Hintergrund eines Phasenkontrastbildes daher dunkel.
Erfahrungsgemäß beträgt die Phasenverschiebung bei der Mehrzahl biologischer Präparate lambda / 4. Der Phasenring ist so gebaut, daß hier eine weitere Verschiebung um nochmals lambda / 4 erfolgt. Zusammen kommt man somit auf eine Erhöhung des Betrags auf lambda / 2. Damit fallen durch Interferenz zwischen gebeugtem und nichtgebeugtem Strahl Wellenberg auf Wellental, und es erfolgt Auslöschung. Ein Nachteil des Verfahrens: Ab einer bestimmten Dicke der Präparate treten helle Höfe um die Strukturen herum auf ("Halo-Effekt").
Dunkelfeldmikroskopie: Bei der Dunkelfeldbeleuchtung arbeitet man mit einem Spezialkondensor, dessen Apertur so groß ist, daß die direkt aus ihm kommenden Lichtstrahlen am Objektiv vorbeigehen. Nur wenn ein Präparat in den Strahlengang gebracht wird, gelangt das von ihm gebeugte Licht in das Objektiv und trägt zur Abbildung bei. Die Strukturen erscheinen leuchtend vor dunklem Hintergrund. Dieser Methode kommt in der Biologie keine allzu große Bedeutung zu; doch recht eindrucksvoll lassen sich mit ihr z.B. Kristalle (isoliert oder intrazellulär) nachweisen.
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